详情

简介

在室温下分子大都处在基态的zui低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到电子激发态的zui低振动能级，能量的这种转移形式，称为跃迁。再由电子激发态的zui低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。

图 1. 荧光机理（Jablonski 图）荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。物质吸收的光，称为激发光。物质所发射的光，称为发射光或荧光。如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光强度所得到的光谱，被称为该荧光物质的激发光谱。选取激发光谱中zui大吸收峰处的波长，固定波长检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱。激发和发射光谱是荧光物质定性的依据。对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。为获得数据，仪器参数的设定尤其重要。在本技术指南中，对Lumina仪器参数的含义进行说明，同时说明设定值变更和荧光光谱变化之间的相关性。

仪器参数

PMT：光电倍增管电压，可增加荧光强度。PMT的设定值越高，荧光强度就越高，不过噪声信号也会增加；因此，可根据样品适当调整。狭缝：可调整光束宽度，光束宽度越宽，到达样品的光束越多，荧光强度也会增加。发射波长间隔：检测样品时，可设定波长间隔。如设定为0.1nm，光束的照射密度会很密，会使检测时间变长。积分时间：检测样品时按照波长间隔向样品照射光束的时间。假设在400～600nm范围内进行发射扫描，积分时间为20ms，如将间隔设为0.1nm，荧光检测步骤如下：400nm波长下，照射20ms；400.1nm波长下，照射20ms；400.2nm波长下，照射20ms。也就是说，随着积分时间的增加，在各波长下照射光束的时间也会增加，使得扫描速率 (nm/min) 变慢，荧光强度增加。

标准样品：

•荧光素 (3×10^-6 M)

上述参数可根据样品进行调整。

图 2. 荧光素的分子结构

•蒽 (1×10-5 M)

图 2. 荧光素的分子结构

2.Lumina荧光分光计

3.Luminous软件

4.荧光比色皿（光程 10 mm）

实验步骤

按照的仪表参数对标准样品（荧光素、蒽）进行检测后，边更改仪表参数设定，边确认荧光光谱的变化。

1.检测标准样品的激发、发射光谱

2.检测不同PMT值下的发射光谱荧光强度变化

3.检测不同狭缝值下的发射光谱荧光强度变化

4.检测不同积分时间值下的发射光谱荧光强度和扫描速率变化

5.检测不同发射波长间隔对扫描速率和荧光光谱的影响

6.检测不同扫描速率对光谱的影响

7.检测不同响应时间对光谱的影响

结果

1.标准样品的激发、发射光谱

图4为按照图5所示仪表参数进行检测的荧光素激发、发射光谱。

图 4. 荧光素 3×10^-6  M 的激发光谱（红色）和发射光谱（黑色）

图 5. 仪器参数设置

2.不同PMT 值对发射光谱的影响

如图6所示，随着荧光素PMT电压的增加，荧光强度会增加。

图7为不同狭缝宽度下荧光强度的变化。通过狭缝宽度的变更，可调整激发光和放射光的量。通过实验可以看出变更狭缝宽度对荧光强度的影响大于变更PMT值对荧光强度的影响。e="宋体" >电压的增加，荧光强度会增加。

图 7.不同狭缝宽度对荧光强度的影响

4.不同积分时间对发射光谱及扫描速度的影响增加积分时间，即增加光束照射样品的时间，发射光强度会增加，还可确认荧光扫描速率也会发生变化。

图 8. 不同积分时间下的荧光强度及扫描速率值的变化

5.不同发射波长间隔下发射光谱的变化Lumina的荧光光谱扫描速度设置为用户自定义时，积分时间、平均数、扫描间隔可以按照自己的意愿进行设定。增加发射波长间隔时，检测间隔会增加，故扫描速率会加快。当扫描速率加快时，如图9所示，光谱 FWHM 变宽。

 图9. 不同发射波长间隔时对荧光强度及扫描速率值影响

 6.不同扫描速率对发射光谱的影响其他参数不变的情况下，随着扫描速率的加快，光谱FWHM变宽。

总结

仪表参数的设定会对光谱数据产生巨大的影响。根据样品类型、浓度及纯度，仪表参数的设定值应会有所不同，检测员需根据样品类型和状态，变更仪表参数的设定值，以求获得的光谱条件。erun:'yes';font-family:'Times New Roman';" > 其他参数不变的情况下，随着扫描速率的加快，光谱FWHM变宽。